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1 范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了進(jìn)出口食品中厭氧亞硫酸鹽還原梭狀芽胞桿菌的檢驗(yàn)方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于進(jìn)出口食品中厭氧亞硫酸鹽還原梭狀芽胞桿菌的檢驗(yàn)。

2 定義

本標(biāo)準(zhǔn)采用下列定義：

厭氧亞硫酸鹽還原梭狀芽胞桿菌

群厭氧、過氧化氫酶陰性、能將亞硫酸鹽還原為硫化物的革蘭氏陽性梭狀芽胞桿菌。是食品、水、食品加工設(shè)備、食品生產(chǎn)環(huán)境等衛(wèi)生狀況的評(píng)估指標(biāo)菌之一。

3 設(shè)備和材料

3.1 均質(zhì)器

3.2 恒溫水浴箱。

3.3 恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃或46℃±1℃。

3.4 厭氧培養(yǎng)裝置。

3.5 菌落計(jì)數(shù)器。

3.6 吸管：1.0mL和10.0mL，分別具有0.1mL和1.0mL刻度。

3.7 培養(yǎng)皿：90mm或100mm。

3.8 低溫冰箱

3.9 顯微鏡。

4 培養(yǎng)基和試劑

4.1 氯化鈉胰蛋白胨稀釋液：見附錄A中A1。

4.2 亞硫酸鐵瓊脂：見附錄A中A2

4.3 庖肉培養(yǎng)基：見附錄A中A3。

4.4 3%過氧化氫溶液：使用前配制。

4.5 緩沖甘油-氯化鈉溶液：見附錄A中A4。

5 樣品制備

5.1 樣品的貯存和運(yùn)送

冷凍樣品如不能立即進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)置于-18C保存；非冷凍而易腐的食品，應(yīng)加等量緩沖甘油-氯化鈉溶液(液體食品應(yīng)加雙料)，置于4C冰箱保存。運(yùn)送樣品時(shí)，應(yīng)采取措施，防止樣品中微生物數(shù)量和性質(zhì)發(fā)生變化。

5.2 制樣

將樣品解凍，取25g移入滅菌均質(zhì)杯，加225mL氯化鈉胰蛋白胨稀釋液，以800r/min~10000r/min均質(zhì)2min。如為液體樣品，則取樣25mL，加人盛有225mL氯化鈉胰蛋白胨稀釋液的500mL稀釋瓶中，搖勻。吸取此1：10樣品勻液10mL，加λ90mL.氯化鈉胰蛋白胨稀釋液中，充分混勻后根據(jù)樣品污染情況做進(jìn)一步的系列十倍遞增稀釋。

若檢測(cè)厭氧亞硫酸鹽還原梭狀芽胞杄菌的芽胞，可對(duì)1：10樣品勻液進(jìn)行75℃ 20min或煮沸保持l0min熱處理，之后以流水迅速冷卻至室溫后再做進(jìn)一步的系列十倍遞增稀釋。

6 檢驗(yàn)步驟與計(jì)數(shù)

6.1 平板計(jì)數(shù)法

適用于檢驗(yàn)未經(jīng)加工處理的生鮮食品及厭氧亞硫酸鹽還原梭狀芽胞桿菌>10/g(mL)的食品。

6.1.1 接種和培養(yǎng)

6.1.1.1 對(duì)每一份試樣，選用適宜的三個(gè)連續(xù)稀釋度的樣液，分別用滅菌吸管吸取1mL，一式雙份接種于每個(gè)滅菌的培養(yǎng)皿中。

6.1.1.2 傾注約15mL制備好的并于水浴箱保溫至50℃的亞硫酸鐵瓊脂。從制備*初稀釋液結(jié)束到傾注培養(yǎng)基于*后一個(gè)平皿所用的時(shí)間不應(yīng)超過15min。仔細(xì)將接種物和培養(yǎng)基充分混勻，水平放置使其凝固。

6.1.1.3 待混合物凝固后，再傾注10mL 2%無菌瓊脂于已凝固的培養(yǎng)基上作為隔層。

6.1.1.4 待該隔層凝固后反轉(zhuǎn)制備好的平板于36℃±1℃厭氧培養(yǎng)24h~48h。若對(duì)培養(yǎng)溫度有特殊要求(如46℃)，可根據(jù)情況進(jìn)行培養(yǎng)。

6.1.2 計(jì)數(shù)

6.1.2.1厭氧亞硫酸鹽還原梭狀芽胞杄菌在亞硫酸鐵瓊脂上呈黑色菌落。36C±1℃厭氧培養(yǎng)24h后，計(jì)數(shù)典型的菌落；若平板上無特征性菌落或菌落較小(<0.5mm)，則需繼續(xù)培養(yǎng)24h再計(jì)數(shù)；若48h后的菌落增大以至相連，則以24h的計(jì)數(shù)為準(zhǔn)，反之則以48h為準(zhǔn)。

那些僅產(chǎn)生氫〔而不是硫化氫(H2S)〕的厭氧菌生長時(shí)也可還原亞硫酸鹽而導(dǎo)致培養(yǎng)基出現(xiàn)彌散的、非典型的普遍變黑，這種現(xiàn)象不應(yīng)計(jì)數(shù)。

6.1.2.2 從可計(jì)數(shù)的平板(具20~200個(gè)菌落)中任取10個(gè)典型菌落，分別取培養(yǎng)物按7.1和7.2進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn)。對(duì)陽性結(jié)果進(jìn)行計(jì)數(shù)。

6.1.2.3 平板典型菌落數(shù)乘以證實(shí)為厭氧亞硫酸鹽還原梭狀芽胞桿菌菌落所占比例，再乘以樣品稀釋倍數(shù)即為樣品中厭氧亞硫酸鹽還原梭狀芽胞杄菌的計(jì)數(shù)，報(bào)告為厭氧亞硫酸鹽還原梭狀芽胞桿菌/g(mL)。

6.2 *近似值(MPN)法

適用于檢驗(yàn)含有受損傷的厭氧亞硫酸鹽還原梭狀芽胞杄菌的加工食品及厭氧亞硫酸鹽還原梭狀芽胞桿菌≤10/g(mL)的食品。

6.2.1 接種和培養(yǎng)

6.2.1.1 增菌

選用適宜的三個(gè)連續(xù)稀釋的樣液，從每個(gè)樣液中分別吸取1mL，一式三份接種于3管裝有庖肉培養(yǎng)基的試管中，36℃±1℃厭氧培養(yǎng)24h~72h。待出現(xiàn)生長特征(培養(yǎng)液混濁、產(chǎn)氣、出現(xiàn)異味)后，進(jìn)行分離培養(yǎng)。反之，則按陰性計(jì)數(shù)。

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